jenabioscience:高保真熒光素PCR標記試劑盒——PCR法制備熒光素標記的DNA探針

Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學家于1998年成立，利用超過25年的學術知識為100多個國家的研究和行業(yè)客戶開發(fā)創(chuàng)新試劑。

供一般實驗室使用。

運輸:凝膠包裝運輸

儲存條件:儲存在-20°C
避免冷凍/解凍循環(huán)，避光儲存

保質期:12個月

光譜特性: λexc492納米，λ全身長的517納米，ε 83.0毫摩爾-1厘米-1(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸，pH 7.5)

描述:
高保真熒光素PCR標記試劑盒設計用于通過PCR隨機產生熒光素修飾的DNA探針。這種探針非常適合熒光原地的雜交(FISH)和Northern印跡實驗。如果模板量有限或需要擴增特定的DNA片段，基于PCR的標記優(yōu)于用Klenow片段的隨機引物標記。高達4kb的探針擴增是可行的。

使用優(yōu)化的反應緩沖液和高保真聚合酶混合物，熒光素-12-dUTP作為其天然對應物dTTP的替代物被有效地摻入到DNA中，所述高保真聚合酶混合物包括Taq聚合酶和校對酶。50 %熒光素-12-dUTP取代通常導致反應和標記效率之間的最佳平衡。然而，熒光素-12-dUTP/dTTP比率的個體優(yōu)化可以容易地用單核苷酸形式實現(xiàn)。

該試劑盒包含足夠的試劑，可用于10次標記反應(S-Pack)或50次標記反應(L-Pack)，每次20μL(50%熒光素-12-dUTP替代，100微米dATP/dGTP/dCTP，50微米dTTP，50微米熒光素-12-dUTP)。

內容:
高保真聚合酶
在含有50%甘油(v/v)的儲存緩沖液中
# APP-101-FAMX-S:1個40微升(100個單位，2.5個單位/微升)
# APP-101-FAMX-L:2個40微升(2個100單位，2.5單位/微升)

高保真標記緩沖液
1個500微升(10倍)

dATP溶液
1個20微升(100毫米)

dGTP解決方案
1個20微升(100毫米)

dCTP溶液
1個20微升(100毫米)

dTTP溶液
1個20微升(100毫米)

熒光素-12-dUTP
# APP-101-FAMX-S:1個10微升(1毫米)
# APP-101-FAMX-L:5個10微升(1毫米)

DNA
1個20微升(100納克/微升)

500 bp正向引物
1個20微升(10微米)

500 bp反向引物
1個20微升(10微米)

PCR級水
1x 1.2毫升

由用戶提供
DNA模板
底漆
DNA純化工具(可選)

1.工作溶液的制備

1.1 1mM dATP/dCTP/dGTP工作溶液的制備

• 將100 mM dATP、100 mM dCTP和100 mM dGTP溶液在冰上、voretex上解凍，并短暫旋轉。
• 用PCR級水制備1:100的稀釋液，以達到1 mM的最終濃度(例如2μl 100mM dATP+2μl 100mM dCTP+2μl 100mM dGTP+194μl PCR級水)。
• 1 mM ATP/CTP/GTP工作溶液可儲存在-20°c下。準備等分試樣以避免冷凍/解凍循環(huán)。

1.2 1mM dTTP工作溶液的制備

• 在冰上融化100 mM dTTP溶液，voretex并短暫旋轉。
• 用PCR級水制備1:100的稀釋液，以達到1 mM的最終濃度(例如2 μl 100 mM dTTP + 198 μl PCR級水)。
• 1 mM dTTP工作液可儲存在-20°c下。準備等分試樣以避免冷凍/解凍循環(huán)。

3.標準PCR標記方案

標準方案用于標記500 bp的DNA片段。反應和標記效率之間的最佳平衡通常是按照下面的標準方案用50%熒光素-12-dUTP取代來實現(xiàn)的，然而，個體優(yōu)化可能改善個體應用的結果。

• 按照下列順序在冰上組裝PCR(無脫氧核糖核酸酶反應管)。
• Voretex和簡單的降速。
• 在弱光條件下進行檢測設置和反應。

推薦的騎行條件

1)退火溫度取決于所用引物的熔化溫度。
2)延伸時間取決于待擴增片段的長度。建議時間為2分鐘/kbp。72°C時的伸長率也同樣有效。

為了獲得最佳擴增結果和高摻入率，對于每個新的引物-模板對，可能需要對推薦的PCR檢測和循環(huán)條件進行單獨優(yōu)化。

4.探針純化:

大多數(shù)雜交實驗不需要探針純化。如果下游應用需要純化(例如通過吸光度測量進行濃度測定)，我們建議采用基于硅膠膜或凝膠過濾的純化方法。

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